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Western Blot原理介紹

  Western Blot(WB),即蛋白免疫印跡法,是定性、定量檢測蛋白表達的一種經典、有效的技術方法。western blot是根據抗原抗體的特異性結合檢測復雜樣品中的某種蛋白的方法。Western blot是在凝膠電泳和固相免疫測定技術基礎上發展起來的一種新的免疫生化技術。由于western blot具有SDS-PAGE的高分辨力和固相免疫測定的高特異性和敏感性,現已成為蛋白分析的一種常規技術。Western blot常用于鑒定某種蛋白,并能對蛋白進行定性和半定量分析。
  Western Blot方法非常成熟,大多實驗室均具備Western Blot的實驗能力。但是要得到一份背景清晰、條帶明亮、真實客觀的實驗結果,需要投入大量的時間和精力,信諾金達生物技術人員,在樣品處理、轉印和抗體稀釋比例等操作上具有特殊的技巧,能夠為客戶的樣品量身定制實驗方案。
Western Blot技術路線
western blot技術路線
Western Blot服務優勢
  1. 高分辨率的電泳技術:聚丙烯酰胺凝膠(polyacrylamide gel,PAGE)把分子篩作用和電荷效應結合在同一方法中,達到更高的靈敏度;
  2. 特異敏感的抗原-抗體反應:抗原抗體的結合實質上是抗原表位與抗體超變區中抗原結合點之間的結合。由于兩者在化學結構和空間構型上呈互補關系,所以抗原與抗體的結合具有高度的特異性。 ;
  3. 1-5ng中等大小的靶蛋白:可檢測到低至1~5ng(最低可到10~100pg)中等大小的靶蛋白。
Western Blot服務要求
  需新鮮或正確保存的蛋白樣品或者蛋白粗提液(總蛋白濃度不低于 2μg/μl(至少50μl)。);或者不少于50mg組織樣品,或者不少于5×10的6次方個細胞的細胞樣品。

  陽性對照樣品(如果有);

  檢測目的蛋白的一抗(自備或者如果是常用的信諾金達會有備貨,不常用的可由信諾金達訂購);

Western Blot步驟
  1、蛋白質抽提 
  A、實驗對象為組織樣品,取適量(250-500mg)新鮮組織樣品,加1ml含蛋白酶抑制劑的總蛋白抽提試劑(或核蛋白抽提試劑),勻漿后抽提總蛋白。 
  B、實驗對象為細胞樣品,每份樣品取1×106~1×107細胞,PBS清洗細胞,去PBS加0.1ml~1ml含蛋白酶抑制劑的總蛋白抽提試劑(或核蛋白抽提試劑)抽提總蛋白。 
  2、蛋白質定量
  按KCTMBCA蛋白質定量試劑盒操作說明操作,測定樣品濃度。 
  3、變性聚丙烯酰胺不連續凝膠電泳(SDS-PAGE) 
  將準備好的樣品液和生物素標記的蛋白質分子量標準分別上樣,標準加進第一個孔中,電泳分離蛋白。 
  4、蛋白質轉移到硝酸纖維膜或PVDF膜 
  5、膜的封閉和抗體孵育 
  A、膜在5%BSA溶液中室溫孵育1小時以封閉膜上的非特異結合。
  B、封閉過的膜加入一級抗體室溫孵育1.5小時,抗原抗體結合。
  C、加入HRP標記的二級抗體以結合一級抗體及HRP標記的抗生物素抗體以結合分子量標準,室溫孵育膜1小時。加入HRP標記的GAPDH抗體可同時檢測GAPDH含量。
  6、結果檢測
   化學發光法檢測,膜與化學發光底物孵育,經X膠片曝光顯影。圖片掃描保存為電腦文件,并用ImageJ分析軟件將圖片上每個特異條帶灰度值的數字化。
  7、數據分析 
   目的蛋白的灰度值除以內參GAPDF的灰度值以校正誤差,所得結果代表某樣品的目的蛋白相對含量。 
  8、提供實驗報告
  包括詳細的實驗方法及Western Blot實驗結果。
Western Blot實驗交付內容
  實驗交付內容包括:蛋白濃度,膠片,膜,以及灰度分析(如果需要)及實驗報告。
  實驗范例圖片:
western blot實驗結果 western blot實驗結果

western blot實驗結果      ; ;  western blot實驗結果

服務編號 服務項目 內容說明 價格 周期
SGSPN01 蛋白抽提 總蛋白 ¥80/樣品 1周
SGSPN02 核漿蛋白分開 ¥200/樣品
SGSPN03 蛋白定量 提供蛋白測定總蛋白濃度 ¥50/樣品 1周
SGSPN04 Western Blot預實驗 Western Blot 檢測一抗體特異性 ¥500/目的蛋白(如做正式實驗此項免費) 1周
SGSPN05 Western Blot Western Blot 標準服務(包括蛋白質提取和定量,Tubulin標定,不含一抗) ¥1300/目的蛋白·膜 2-3周#
SGSPN06 SDS-PAGE 客戶提供蛋白樣品 ¥500/組 1-2周

#:一般狀況下,2周即可完成實驗。如遇特殊情況,如一抗不好,蛋白濃度低或蛋白特殊像分子量大等,周期會有所延長。

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